肺癌的基因治療
肺癌的基因治療
中華結核和呼吸感染 1999年第5期第22卷 綜述
作者：劉宏旭 許順 趙惠儒 殷洪年
單位：110001 瀋陽，中國醫科大學附屬第一醫院胸外科。
在過去的50年裡，肺癌的療效提高極其緩慢。非小細胞肺癌(nsclc)患者的生存曲線幾乎沒有改變；而小細胞肺癌(sclc)患者由於化療的進展使生存期明顯延長，但是幾乎沒有徹底治癒的病例，因此迫切需要新的有效治療手段的出現。
隨著現代分子生物學的不斷髮展，尤其是dna重組技術和基因轉移技術的逐步成熟，肺癌的基因治療成為極有發展前景的治療方法。
研究表明，肺癌的發生是由於某些原癌基因的啟用、抑癌基因的失活和凋亡相關基因的改變導致細胞增殖和死亡異常的結果［1］。其發生是多階段、多步驟、多基因參與的過程，在不同階段相繼或同時有不同基因的改變。在原癌基因中常見發生改變的基因為k-ras、l-myc、c-erbb-2和bcl-2。抑癌基因中常見改變的基因為p53、rb和p16，凋亡相關基因中常見改變的基因為p53、bcl-2、c-myc和ras。針對肺癌發生的分子生物學特點，可以透過基因轉移技術，引入新的外源目的基因到腫瘤細胞或其它體細胞內以糾正或補償缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的，這就是肺癌的基因治療。其可以分為對宿主細胞的基因修飾和對肺癌細胞的基因修飾。肺癌的基因治療包括：抑癌基因治療、反義基因治療、藥物敏感基因治療、免疫基因治療、多耐藥基因治療和核酶(ribozyme)基因治療，通常採用的治療基因見表1［2］，常用的載體為反轉錄病毒(rv)和腺病毒(av)。
一、抑癌基因治療
細胞內抑癌基因的丟失或突變將導致細胞發生惡變。抑癌基因治療是一種基因替代療法，即用野生型的抑癌基因
| 靶細胞 |
匯入的目的基因
表1 常用肺癌治療基因
替代失活的抑癌基因，從而達到治療腫瘤的目的。目前研究較多的是p53基因，對於p53基因發生失活的nsclc細胞，透過rv或av載體匯入野生型p53基因後發現：腫瘤縮小，細胞惡性程度降低，甚至發生逆轉，治療後分析活檢標本發現，腫瘤細胞有p53基因的轉移且凋亡細胞明顯增多，本結果提示p53可以透過抑制腫瘤生長並誘導細胞凋亡而殺滅腫瘤細胞［3］。對無法切除的てnsclc患者，經纖維支氣管鏡或ct引導的經皮穿刺針區域性注入av介導的野生型p53基因，並聯合應用化療藥順鉑，發現腫塊明顯縮小及細胞凋亡增多［4］；對於傳統手術及放療、化療效果不理想，且腫瘤阻塞氣道明顯者，可採用匯入野生型p53基因和反義k-ras基因治療。目前此兩方案已被美國重組dna顧問委員會(rac)批准為臨床治療方案［5］。當然，轉移野生型p53基因治療肺癌的前提是，腫瘤細胞內必須有該基因缺陷，對p53功能正常的肺癌細胞，此法一般無效。
二、反義基因治療
反義基因治療就是基因封閉或基因滅活，即用反義核酸在轉錄和翻譯水平阻斷某些異常基因的表達，阻斷細胞內異常訊號傳導，使腫瘤細胞進入正常分化軌道或者引起細胞凋亡。包括反義癌基因治療，反義多耐藥基因治療，反義免疫抑制因子基因治療等。
反義基因治療分為反義dna治療和反義rna治療。反義dna治療是指短鏈dna可插入細胞內dna雙螺旋，形成三螺旋結構，阻礙mrna的轉錄；或短鏈dna與突變靶基因的mrna相互補，形成rna-dna複合體，使突變基因的表達受到抑制。反義rna是指用一類反義rna影響mrna的加工成熟或直接與mrna結合而抑制癌基因蛋白產物的生成，反義rna治療在胞漿內進行，技術易行，應用較廣泛。
1.反義癌基因治療：有文獻報道，將反義k-ras基因的重組表達質粒匯入有k-ras基因異常的人nsclc細胞中，該質粒在細胞內表達反義k-ras rna，結果肺癌細胞內k-ras mrna的表達幾乎完全抑制，其產物p21蛋白的合成減少了70%～90%，細胞生長速度減慢了3倍，裸鼠成瘤性(tumori genicity)下降［6］。反義c-erbb-2基因的表達能抑制有c-erbb-2過度表達的肺腺癌細胞的成瘤性［7］。反義l-myc dna匯入，能明顯抑制sclc細胞的增生。
2.反義多耐藥基因治療：肺癌產生耐藥性的主要原因是多耐藥基因(mdr-1)表達增強及其編碼產物p-糖蛋白(pgp)增多。pgp具有藥物泵的作用，把進入細胞內的藥物運到細胞外，腫瘤細胞因而耐藥。因此，逆轉耐藥基因是成功治療肺癌的關鍵。用構建反義mdr-1重組逆轉錄病毒載體，轉染肺腺癌細胞後發現腫瘤細胞內mdr-1 mrna的表達受到抑制，pgp表達明顯下降，腫瘤細胞對化療藥物的敏感性增強［8］。除了mdr-1基因外，多耐藥相關蛋白基因(mrp)基因在腫瘤耐藥中也起重要作用。反義mrp rna和反義mdr-1 rna共同轉染的肺腺癌細胞耐藥性下降了約90%。另外，野生型p53基因除了有腫瘤生長抑制和誘導細胞凋亡作用外，還可以增加藥物敏感性，而突變型p53基因與腫瘤耐藥性密切相關［9］。因此可以用反義突變型p53基因轉染肺癌細胞，進行反義基因治療，以增強對化療藥物的敏感性。
3.反義轉化生長因子β(tgt-β)基因治療：該方法同時也是一種免疫基因治療，透過轉染反義核酸可抑制免疫抑制因子tgf-β的產生，因而增強機體的免疫力。
由此可見，反義基因治療具有高特異性及較短的外源基因可封閉較大資訊量的突變基因等特點，成為較為合理的治療方法，有很好地應用和開發前景。但仍有許多問題需要解決，如細胞轉染率低，載體在細胞記憶體在時間較短，寡聚脫氧核苷酸易被降解和攝取率較低等。
三、免疫基因治療
免疫基因治療即採用一定的方法或載體將目的基因匯入腫瘤細胞或效應細胞-腫瘤浸潤淋巴細胞(til)，然後將表達目的基因的受體細胞輸入患者體內，透過提高人體免疫系統對腫瘤細胞的識別、抑制或殺傷能力從而對腫瘤進行治療的一種方法。治療途徑可以透過直接轉染腫瘤細胞製成瘤苗，也可以透過轉染效應細胞來增強效應細胞的抗腫瘤能力。
1.轉染肺癌細胞的免疫基因治療：肺癌細胞能逃離線體免疫系統殺傷的重要機制之一為：腫瘤細胞的免疫原性弱，不足以刺激機體免疫系統產生對腫瘤的排斥反應。因此向腫瘤細胞內匯入目的基因以增強腫瘤的免疫原性，可以被機體免疫系統識別，從而進行免疫基因治療。主要包括：(1)抗原物質基因治療：已證實向肺癌細胞匯入主要組織相容複合物±嗷因(mhc-)能增強免疫原性，並被腫瘤特異性細胞毒淋巴細胞(ctl)所殺傷，同時mhc-1的表達能降低成瘤性［10］。(2)細胞因子基因治療：將細胞因子基因透過基因轉染技術，匯入到某種運載細胞基因組中，使其表達，再將這些運載細胞回輸到人體內，透過其聚集在腫瘤區域性，持續分泌一定量的細胞因子來啟用機體抗腫瘤免疫反應或直接殺傷腫瘤細胞。其優點為，定向力和殺傷力強。通常將細胞因子基因如白細胞介素基因il-2，il-4，il-6，il-7，il-12，腫瘤壞死因子(tnf)，干擾素γ(ifn-γ)和粒/巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)基因等匯入腫瘤細胞促進抗原表達以增強免疫原性，促進t細胞、自然殺傷(nk)細胞增生和殺傷活性，並降低腫瘤的成瘤性［11］。(3)協同刺激訊號基因(b7)基因治療：作為協同刺激訊號(costimulatory signal)，b7基因匯入能促進t細胞增生，提高t細胞殺傷能力，誘導機體免疫系統對抗原的清除。
以上為向腫瘤細胞單獨匯入目的基因，近來有人向肺癌細胞聯合匯入b7基因和il-12基因［12］、il-2基因和tnf基因［13］、il-2基因和il-6基因［14］，發現能更有效地啟用免疫功能達到更佳的抗腫瘤效果。
2.轉染效應細胞(til)的免疫基因治療：研究表明：對til細胞做必要的修飾之後，能在很大程度上增強它的殺傷能力，常用於插入til細胞的基因主要為il-2，il-6，ifn-γ，tnf等細胞因子基因。先將肺癌細胞取出，於存在il-2的條件下培養以篩選til細胞，用重組有上述基因的rv轉染til細胞，經此修飾的til細胞回輸到患者腫瘤組織中去後便能表達il-2，il-6，tnf-γ，tnf等以提高機體對腫瘤的免疫能力［15］。不久前，美國學者hoffmann與國內哈爾濱醫科大學聯合進行臨床試驗［16］，將rv介導il-2基因插入的til細胞注入患者胸腔，治療惡性胸液，結果證實該方法的安全性並有一定的療效。
免疫基因治療還包括用痘苗病毒載體(vv)介導部分癌胚抗原(cea)基因轉染受體細胞，以增強免疫原性；反義tgf-β基因治療以抑制免疫抑制因子的產生等治療手段。
四、藥物敏感基因治療
匯入的藥物敏感基因在細胞內表達後，可以將原來無毒或低毒的藥物轉變為細胞毒性產物，進而殺傷細胞。由於細胞本身基因表達以後才對藥物敏感，類似細胞自殺，所以該類基因又稱自殺基因，主要有：單純皰疹病毒胸苷激酶基因(hsv-tk)和細菌胞嘧啶脫氨酶基因(bacterial cytosinedeaminase gene)。目前研究最多的為hsv-tk基因，其作用原理為：將hsv-tk基因透過反轉錄病毒載體匯入肺癌細胞中，tk基因表達產物能使沒有細胞毒性的環核苷丙氧鳥苷(gcv)活化，活化後的gcv能抑制dna合成，從而特異性殺傷肺癌細胞［17］。與hsv-tk基因作用類似，細菌胞嘧啶脫氨酶基因表達產物，能將5-氟胞嘧啶轉化為具有細胞毒和抗代謝活性的5-氟尿嘧啶(5-fu)，從而特異性殺傷腫瘤細胞［18］。
藥物敏感基因治療優點：特異性殺傷腫瘤細胞，而正常細胞不受損害；未轉染腫瘤細胞有旁觀效應(bystander effect)，因此不需要所有腫瘤細胞都被轉導；能同時增加機體對腫瘤細胞的免疫反應。缺點：必須確保只有腫瘤細胞被轉導，而正常細胞未被轉導［19］。
五、多耐藥基因治療
將一些抗細胞毒藥物的基因(如mdr-1)轉移至造血幹細胞，以降低化療藥物對骨髓的毒性，這樣就可能用高劑量的藥物殺傷腫瘤細胞而不破壞骨髓細胞。如向造血幹細胞中匯入二氫葉酸還原酶(dhfr)基因，可使骨髓中正常細胞獲得對氨甲喋呤(mtx)的抗藥性；將mdr-1基因匯入細胞粘附分子34(cd34)陽性的造血幹細胞，可降低化療藥對造血系統的毒性反應［20］。nsclc對化療通常不敏感，因此多耐藥34基因治療適用於sclc患者。然而，如果造血幹細胞已經有高水平表達的mdr-1，浸潤於骨髓的腫瘤細胞可能獲此基因，從而對化療耐藥，這是該治療的一個不足。
六、核酶基因治療
這是最近發展起來的基因治療手段。核酶基因是一類具有rna限制性內切酶活性的rna分子，可以識別rna序列中的某些序列並進行有效切割，能特異性滅活rna，因此是一種很有前景的抗病毒和抗腫瘤分子。在有mdr基因表達的腫瘤細胞匯入特異的核酶基因逆轉錄病毒表達載體可有效切割mdr-1 mrna，阻斷pgp表達，增強藥物敏感性，降低耐藥［21］。
七、存在問題及展望
基因治療作為一種嶄新的治療手段，為肺癌的攻克帶來了希望，但目前還很不成熟，存在一些問題，主要表現為：
1.缺乏理想的基因載體：理想的基因載體是能將遺傳物質安全、高效地轉移，並且定點整合到細胞基因組中，在細胞中長期穩定、特異表達或按一定要求調控表達，而且應用方便。目前的載體距離理想載體還有很大差距，但在構建靶向性基因轉移的載體方面已取得了一些進展，如透過構建由特異性啟動子訊號誘導的增生相關蛋白(spa-1)、猿猴病毒40(sv40)、癌胚抗原(cea)等啟動子調控的hsv-tk表達載體，能夠提高hsv-tk在腫瘤中的特異性表達及減少對正常細胞的損傷［22］。
2.難以尋找新的有效目的基因和加強目的基因的功能：肺癌是多基因疾病，這加大了尋找有效目的基因的難度。最初人們懷疑，在肺癌多基因、多階段演變過程中，單一突變基因的改變是否會明顯影響腫瘤的程序。但是，越來越多證據表明某一關鍵基因的糾正確實能有效地抑制人肺癌細胞的成瘤性，特別是當該基因的糾正將使凋亡途徑的活性上調。因此新的有效基因，其表達應該既能抑制、殺傷腫瘤細胞，又能誘導其凋亡［23］。
3.聯合治療的前景：聯合治療包括基因治療與放療或化療間的聯合，不同基因治療策略間的聯合等。最新研究成果表明，對nsclc患者進行基因治療結合放療或化療［24］；對肺癌肝轉移患者行腺病毒介導的自殺基因(hsv-tk)聯合細胞因子(il-2)基因治療均取得較為滿意的療效［25］，可見聯合治療有著極為廣闊的前景。
可以肯定，隨著對肺癌發生分子機制認識的加深和基因工程技術的發展，肺癌基因治療不久將會有重大突破，並可能成為下個世紀肺癌治療的主要手段之一。
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(收稿：1998-04-30 修回：1998-07-14)
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