實驗性變應性猴腦脊髓炎的超微結構改變

　　實驗性變應性猴腦脊髓炎的超微結構改變

　　中華神經科雜誌 1998年第6期第31卷 論著

　　作者：胡學強　陸正齊　饒從志　吳金浪　吳義芳

　　單位：510630　廣州，中山醫科大學附屬第三醫院神經科（胡學強、陸正齊、饒從志），電鏡室（吳金浪、吳義芳）

　　關鍵詞： 食蟹猴；腦脊髓炎；實驗性變態反應性；多發性硬化；超微結構

　　【摘要】　目的　探討自身免疫性中樞神經系統(cns)脫髓鞘的病理特點和發病過程。方法　建立猴實驗性變態反應性腦脊髓炎(eae)的模型，並從病情不同階段進行病理取材和電鏡觀察。結果(1)eae脫髓鞘最早的靶是少突膠質細胞(odc)，而不是髓鞘本身；(2)無論急性期還是慢性期，脫髓鞘病灶內只有極少的炎細胞浸入；(3)急性期髓鞘改變輕微，以變性為主，odc腫脹顯著，軸突相對完整。遠離髓鞘變性區有大量炎細胞浸入；(4)慢性期病變區髓鞘脫失明顯，odc嚴重變性或部分丟失，繼發性軸突變性，邊緣可見少量薄的髓鞘再生，血腦屏障破壞。結論　eae的cns脫髓鞘過程首先累及odc。

　　ultrastructure of acute and chronic experimental allergic encephalomyelitis in cynomolgus monkeys　hu xueqiang, lu zhengqi, rao congzhi, et al. department of neurology, the third affliated hospital, sun-yat-sen university of medical science，guangzhou 510630

　　【abstract】　objective　to investigate the pathological features and the initiating factor of autoimmune cns demyelinating diseases. methods the animal models of experimental allergic encephalomyelitis (eae) in cynomolgus monkeys were established. following, two eae animals respectively during the acute and chronic stages were killed, and a healthy monkey was killed, too. numerous brain blocks was obtained from the above-mentiond three animals and the observations were made under an electron microscope.results the findings demonstrated that (1) the first target attacked by the immune events was oligodendrocytes, but not the myelin sheaths itself: (2) during the acute stage or chronic stage, in the demyelinating plaques, there were only a few inflammentory, cells infiltration; (3) in the acute stage, the myelin sheaths were markedly loosen and the axon-myelins seperated, but the axons were relatively perserved and in the patch away from the degenerated myelin there were a number of inflammentory cellular infiltrations; (4) in chronic lesions, myelin sheath loss was obvious, secondary axonal injuries was severe, including axon swelling and loss with oligodendrocytes markedly reduced or degenerated, but there were fewest in flammentory cells seen at the edge of the lesions with thin remyelination and persistently damaged blood brain barrier. conclusion our studies indicated that the demyelinating process of eae possibely involved the oligodendrocytes primarily.

　　【key words】　cynomolgus　　experimental allergic encephalomyelitis 　　multiple sclerosis　　ultrastructure

　　中樞神經系統(cns)脫髓鞘疾病中免疫因素攻擊最早的靶是髓鞘本身還是少突神經膠質細胞(odc),目前尚不清楚［1］。實驗性變態反應性腦脊髓炎(eae)是脫髓鞘疾病的動物模型［2］。我們從猴eae腦和脊髓的超微結構方面,將急、慢性eae進行比較,旨在透過了解猴急、慢性eae的病理特點cns脫髓鞘的發生過程,進一步明確脫髓鞘疾病的發病機制。

　　材料和方法

　　1.實驗材料:選擇廣東省實驗動物研究中心提供的食蟹猴13只,其中雌性8只、雄性5只。單籠餵養,健康狀態良好(合格證號:粵檢證記97a015號)。

　　2.建立eae模型:新鮮食蟹猴腦,提取腦白質,加磷酸鹽緩衝液（pbs）製成腦白質勻漿,再加完全福氏佐劑(cfa)配成腦白質勻漿乳化劑,多部位皮下注射12只實驗動物,1周後再重複注射1次。隨機選擇6號猴作對照組皮下注射pbs和cfa。

　　3.臨床評價:評價標準參考massacesi等［3］的猴eae臨床病情評分辦法。每日觀察實驗猴的病情變化,每週1次腦脊液細胞學檢查,病理解剖前作頭顱mri至少1次。

　　4.臨床病程評價:按照poser等［4］的多發性硬化（ms）臨床病程評價標準將eae分成急性型和慢性型（包括慢性進展型和慢性復發及緩解型）。

　　5.病例選擇:12只實驗猴全部發病,其中5只為慢性型,7只為急性型。選擇臨床症狀明顯發病2周後的13號猴作為急性型代表,選擇病程10個月有復發與緩解的11號猴作為慢性型代表,並與6號健康猴作對照。

　　6.病理取材:用3％的***腹腔內注射麻醉動物,從頸靜脈放血處死，開顱取腦和脊髓,觀察其形態及有無充血和水腫,並稱重。迅速將腦和脊髓沿冠狀面每隔約0.5 cm厚切開,在大體觀察有病變的部位及附近進行取材,如11號猴的基底節區、小腦、橋腦,13號猴的顳葉深部白質、小腦、橋腦等多處取約花生米大小的組織塊。對照組也在相同部位取材。

　　7.電鏡切片製作方法［5］與觀察:迅速用2.5％的戊二醛作前固定,然後取出，分成1 mm×1 mm×1 mm大小,用***後固定1.5小時, 用epon812包埋機包埋,用leica超簿切片機切片,醋酸鈉及檸檬酸雙重染色,用日立h-600透射電鏡觀察。

　　結果

　　1.急、慢性eae猴mri表現：急性eae猴(13號)腦mri橫斷面t2加權像示顳葉深部白質點狀高訊號影,t1未見異常；慢性eae猴(11號)腦冠狀面mri t2加權像示基底節區條索狀高訊號影,t1為低訊號。對照組未見異常。

　　2.大體觀察：慢性eae猴(11號)雙側基底節區見1個3 mm×5 mm大小的灰白色病灶,右側小腦深部白質見3 mm×3 mm的灰白色病灶。橋腦腹側見1個2 mm×2 mm的暗紅色病灶。脊髓c7、t1和t7介面不清。

　　急性eae猴(13)雙側顳葉深部白質見3 mm×3 mm大小的暗紅色病灶,頂葉白質見3 mm×2 mm大小暗紅色病灶。腦幹、小腦、脊髓未見異常。

　　3.電鏡所見：急性eae顳葉深部白質、小腦、橋腦可見到正常的髓鞘內odc胞漿已明顯水腫(圖1)。髓鞘內板層鬆解和軸突髓鞘分離,而此時髓鞘外板層正常,髓鞘內軸突完好,但odc內水腫明顯,線粒體腫脹,嵴模糊或斷裂,核部分溶解 (圖2)。有些髓鞘均勻一致腫脹鬆解(圖3)，脫髓鞘病灶內罕見炎細胞,毛細血管內皮細胞腫脹,緊密連線模糊或斷裂,毛細血管周邊星形細胞腫脹明顯(圖4),遠離病變區可見大量炎細胞浸入,以淋巴細胞為主,其次為小膠質細胞和單核巨噬細胞。慢性eae基底節區、小腦及橋腦白質內見明顯的髓鞘脫失或脫落傾向(圖5),軸突明顯減少,脫髓鞘的軸突變性(圖6)。病灶中間見極少的淋巴細胞和較多的吞噬髓鞘的巨噬細胞。病灶邊緣的軸突有些有簿而規則的髓鞘,其中的odc胞漿內含豐富的微管和內質網,但軸突正常。毛細血管內皮細胞核、基底膜及緊密連線基本正常,附近的星形細胞未見腫脹。

　　討論

　　eae是脫髓鞘疾病的動物模型，其中急性eae和超急性eae分別是急性播散性腦脊髓炎和急性出血壞死性白質腦病的動物模型,而慢性eae是ms的理想模型。戚曉昆等［6］近來對豚鼠eae的電鏡研究發現,髓鞘薄層環形結構鬆散、斷裂;薄髓鞘的軸索內可見線粒體腫脹和消失,而厚髓鞘的軸索內線粒體尚好。結果也證實eae表現為髓鞘脫失。

　　cns脫髓鞘疾病中免疫因素攻擊最早的靶是髓鞘本身還是odc？目前有兩種看法。大多數學者 在研究ms的脫髓鞘病理時認為血管周圍炎細胞浸入以致髓鞘破壞［7～9］。而也有學者認為免疫細胞首先殺傷odc,而炎細胞是損傷後的反應產物［10，11］。

　　我們將食蟹猴急、慢性eae的超微結構進行對照研究,結果發現有以下特點:(1)脫髓鞘的病灶內極少見淋巴細胞浸入;髓鞘內板層鬆解和軸突髓鞘分離,而此時髓鞘外板層正常;odc內水腫已明顯,而髓鞘基本正常。提示eae脫髓鞘最早的靶是少突膠質細胞(odc),而不是髓鞘本身。 (2)無論急性期還是慢性期，脫髓鞘病灶內只有極少的炎細胞浸入。(3)急性期髓鞘改變輕微,以變性為主,odc腫脹顯著,軸突相對完整。遠離髓鞘變性區有大量炎細胞浸入,以淋巴細胞為主;(4)慢性期病變區髓鞘脫失明顯,odc嚴重變性或部分丟失,脫髓鞘的軸突嚴重變性或丟失；(5)慢性eae病灶邊緣簿而規則的髓鞘內軸突正常,但odc不成熟,胞漿內含豐富的微管和內質網，提示少量薄的髓鞘再生；(6)急性eae有明顯的血腦屏障破壞,理由是毛細血管內皮細胞緊密連線破壞和附近的星形細胞偽足腫脹，有明顯的血腦屏障破壞。我們對猴急、慢性eae的超微結構研究提示eae的cns脫髓鞘過程首先累及odc。

　　圖1 odc胞漿明顯水腫，但髓鞘正常 em10000

　　2 軸突與髓鞘分離，髓鞘內板層鬆解，odc部分胞漿腫脹 em15000

　　3 髓鞘全層鬆解 em15000

　　4 內皮細胞基底部分破壞，周圍的星形細胞偽足明顯水腫 em12000

　　5 髓鞘部分脫失，軸突輕度變性，內含的線粒體嵴模糊，內質網擴張 em10000

　　6 髓鞘幾乎完全脫失，而軸突僅輕度變效能 em8000

　　參考文獻

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　　本課題為國家自然科學基金（no.39270275）和國家教委博士點基金贊助專案

　　(收稿：1997-12-28　　修回：1998-09-03)