過敏性紫癜患兒外周血單個核細胞活化、凋亡、分泌功能測定

季 平 盧思廣 陳 軍 2005-12-13 12:59:46 中華醫學實踐雜誌 2004年2月第3卷第2期

【摘要】 目的 系統地研究hsp患兒t淋巴細胞的免疫功能及地塞米松的作用機制。方法 hsp患兒和健康兒童的外周血單個核細胞（pbmc）（分地塞米松組和空白對照組）體外培養後以流式細胞儀檢測t淋巴細胞活化抗原cd ₃ cd ₂₅ 及t淋巴細胞的凋亡百分比，以elisa法檢測白細胞介素-2（il-2）、白細胞介素-4（il-4）的水平。結果 hsp患兒與健康兒童比較，pbmc的cd ₃ cd ₂₅ 抗原表達量明顯升高（p=0.011），il-2水平明顯降低（p=0.0056），il-4水平明顯升高（p=0.00023），凋亡百分比明顯降低（p=0.003）;hsp患兒地塞米松組與空白對照組比較，cd ₃ cd ₂₅ 抗原表達量明顯降低（p=0.024），il-2水平稍有下降但差異無顯著性（p=0.569），il-4水平明顯降低（p=0.001），t淋巴細胞凋亡百分比明顯升高（p=0.017）;hsp患兒il-2水平與凋亡百分比呈正相關（r=0.716，p<0.01），il-4水平與cd ₃cd ₂₅ 抗原表達量呈正相關（r=0.785，p<0.01）。結論 hsp患兒存在pbmc活化亢進，il-2水平明顯降低而il-4水平明顯升高，且凋亡延遲;il-2水平越低t淋巴細胞凋亡越延遲;il-4水平越高t淋巴細胞活化越多;地塞米松可能是透過調節th ₁ 、th ₂ 細胞網路的平衡，抑制t淋巴細胞的活化及促進t淋巴細胞的凋亡而發揮作用。關鍵詞 過敏性紫癜 活化 分泌 凋亡地塞米松

to systematically explore the activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral

blood mononuclear cells（pbmc） in children with henoch-schonlein purpura（hsp）

ji ping，lu siguang，chen jun.

the affiliated hospital of xuzhou medical college，jiangsu222500.

【abstract】 objective to systematically explore the immune function and thetreatment effects of dexametha_ˉsone（dex）in children with henoch-schonlein purpura（hsp）.methods the changes of activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral blood mononuclear cells（pbmc）in children with hsp and healthy children，and contrast with the effects of dexamethasone（dex）respectively were observed.the expression of cultured pbmc activa_ˉtion markers such as cd ₃ ，cd ₂₅ on cell surface were assayed with flow cytometry（facs）and apoptosis cell count of pbmc were also measured by facs.cytokines such as il-2，il-4in the supernatantof cultured pbmc were de_ˉtected by elisa.results the percentage of cd ₃⁺ cd ₂₅⁺ cells was significantly higher（p=0.011），the level of il-4was significantlyhigher（p=0.00023）and il-2significantly lower（p=0.0056），while the rate of apoptosis was significantly lower（p=0.03）in the children with hsp than that of the healthy children.after affected by dex in the hsp patient，the percentage of cd ⁺₃ cd ₂₅⁺ （p=0.024）cells decreased significantly（p=0.028），the level of il-4decreased significantly（p=0.001），the rate of lymphocytes apoptosis increased significantly（p=0.017）;the level of il-2decreased，but the difference was not significant（p=0.569）.the elevated level of il-4positively correlated with the increased expression of cd ₃ cd ₂₅ in the hsp patients（r=0.785，p<0.01）.the decreased level of il-2positively correlated with the rate of t lymphocytes apoptosis in the hsp patients（r=0.716，p<0.01）.conclusion there exist multiple immune regulatory disturbance in hsp patients，for example，the function of th ₁ was decreased while the function of th ₂ was increased，lymphocytes apoptosis wasdelay and activation of pbmc was significantly in_ˉcreased.the treatment of dexhas obvious immune regulatory effect and is an effective therapy，such as inhibitingt-cell’s activation，raising the rate of t-cell’s apoptosis and inhibiting the function of th ₂ .

key words henoch-schonlein purpura activation secretion apoptosis dexamethasone

過敏性紫癜（hsp）可能與iga介導的免疫反應有關，是由於抗原抗體免疫複合物沉積、啟用補體，導致毛細血管和小血管及其周圍產生炎症，血管壁通透性增高，從而產生紫癜和各種區域性或全身症狀，所以該病是一種免疫複合物介導的系統性小血管炎。hsp患兒存在免疫功能紊亂，主要表現為細胞免疫功能低下，炎症介質分泌增多，多克隆b細胞活化及免疫球蛋白的分泌增加。雖然國內已有許多學者對hsp患兒的免疫功能做了相關報道，但系統研究仍較少，本文就hsp患兒外周血單個核細胞的免疫功能及地塞米松作用做了系統的研究，為該病的治療和判斷預後尋求新的途徑提供依據。具體如下。

1 材料與方法

1.1 研究物件 hsp組患兒16例（均來自於徐州醫學院附屬醫院兒科），其中男9例，女7例，平均年齡為7.5歲，均符合《實用兒科學》（第6版）診斷標準，且近一個月未用過地塞米松等免疫抑制劑（臨床一般資料見表1）。另外選擇20例健康同齡兒童（採血前健康，無服用糖皮質激素等免疫抑制劑史）作為正常對照組。並且分別在每組內分設兩組，一組為地塞米松組，另一組為空白對照組。

1.2 實驗方法及步驟

1.2.1 密度梯度離心法制備單個核細胞，用rpmi-1640完全培養液調備細胞懸液;0.4%臺盼蘭排除計數，活細胞數>95%。

1.2.2 淋巴細胞凋亡的檢測 （1）細胞培養:用rpmi-1640完全培養液調細胞數達1×10 ⁶/ml，分設2組:地塞米松組:地塞米松100μl+1ml細胞懸液;空白對照組:1ml細胞懸液+rpmi-1640完全培養液100μl。使每組地塞米松終濃度為1×10 ^-5 mol/l，加24孔培養板上置37℃、5%co ₂ 加溼孵箱中培養72h。（2）將以上2組培養的細胞懸液1500r/min離心5min收取細胞，pbs液2ml洗滌2次後用75%乙醇固定，置-20℃冰箱凍存12h以上。（3）將乙醇固定的細胞懸液1500r/min離心5min收取細胞，再用pbs液洗滌2次，然後用1ml pi工作液將細胞重懸，4℃避光孵育30min。（4）流式細胞儀分析:凋亡細胞在流式細胞儀（美國calibur公司）檢測dna直方圖上呈現特徵性的二倍體峰，按500～600cells/s計數1×10 ⁴ 個細胞。根據二倍體及亞二倍體峰，用modfit lt-unititle分析軟體分析細胞凋亡率（apo）。1.2.3 淋巴細胞cd ₃ cd ₂₅ 抗原的檢測 （1）取rpmi-1640完全培養液調細胞數達1×10 ⁶ /ml，分2組，分組方法同上。置24孔培養板中於37℃、5%co ₂ 加溼孵箱中培養72h。 （2）每組中分別加入cd ₃ 單抗（鼠抗人cd ₃ -igg/fitc，購自iq公司）15μl、cd ₂₅ 單抗（鼠抗人cd ₂₅ -igg/pe，購自iq公司）15μl，37℃孵育30min;收取細胞後用pbs液1500r/min離心5min，洗滌2次;加pbs液1ml重懸細胞送流式細胞儀檢測cd ₃ cd ₂₅ 表達量。1.2.4 淋巴細胞分泌的il-2、il-4水平的檢測 （1）用rpmi-1640完全培養液調細胞數達1×10 ⁶ /ml，分組同上，加入24孔培養板上，置37℃、5%co ₂ 加溼孵箱中培養72h。（2）收取培養的細胞懸液於ep管中，以8000r/min離心5min，收集上清液置-70℃冰箱中凍存待檢;用eilsa法檢測il-2、il-4含量。（按華美公司elisa試劑盒上的操作說明書進行操作）。

1.2.5 統計學處理 所有資料均以x±s表示，用excel統計軟體對結果進行t檢驗及線性迴歸分析，p<0.05為統計學差異有顯著性。

2 實驗結果

見表1。

2.1 cd ₃ cd ₂₅ 表達量 hsp患兒pbmc中cd ₃ cd ₂₅ 表達量較健康兒童明顯升高（p=0.011），而hsp患兒地塞米松組與空白對照組比較cd 3 cd 25 表達量明顯降低（p=0.024）。見圖1、圖2。

2.2 il-2、il-4水平 hsp患兒il-2水平較健康兒童明顯下降（p=0.0056），hsp患兒地塞米松組il-2水平較空白對照組稍有下降，但差異無顯著性（p=0.56）;hsp患兒il-4水平較健康兒童明顯升高（p=0.00023），hsp患兒地塞米松組il-4水平較空白對照組明顯下