軟骨發育不全產前基因診斷

1　胎兒dna採集
1. 1　超聲引導下經皮臍靜脈穿刺
　超聲引導下經皮臍靜脈穿刺獲取純胎兒血標本 ,再從胎兒血中提取 dna ,其靈敏度和準確性是其他方法無法比擬的 ,但因繫有創性的產前診斷方法 ,故不宜作疾病篩查用 ,一般對有家族史或經影象學檢查高度懷疑軟骨發育不全而需基因診斷確診的胎兒採用此方法較能為孕婦及家屬所接受。提高臍靜脈穿刺的成功率及安全性 ,是此項技術的關鍵。馬小燕等用此方法抽取胎兒血液,穿刺成功率98.7 %。
1. 2　絨毛活檢術
　多數學者主張在妊娠8周後進行,過早胎盤絨毛太薄,超聲下難以與包繞它的蛻膜組織區分開 ,且不易取得絨毛組織,有報道認為過早絨毛活檢有導致胎兒肢端發育障礙的風險。採取5mg絨毛即可用來進行dna分析,活檢有經腹和經宮頸兩種方式。antoniadi等用此方法對包括軟骨發育不全在內的多種遺傳病進行了基因診斷,並認為如果操作規範這是避免來源母體dna汙染標本較好的方法。
1. 3　母體血中富集胎兒dna
　從1997年學者們在懷男胎的母體血漿或血清中發現存在胎兒dna以來,從孕婦外周血中分離胎兒細胞一直是遺傳病非創傷性產前診斷的主要思路與探索途徑。hiroshi等用此方法嘗試對軟骨發育不全進行基因診斷取得了成功。然而胎兒細胞的富集效率低和母體背景過高影響了胎兒特異等位基因的檢測,使其難以成為臨床實用的非創傷性產前診斷的檢測方法。
1. 4　羊水細胞培養
　1966 年 stede 和 breg首次培養羊水細胞成功並用於胎兒染色體疾病的產前診斷 ,此後這項技術成為產前診斷的一種重要手段。然而,由於羊水中活細胞少,培養週期長 ,無菌要求高 ,稍不注意即致失敗 ,即使培養成功,因分裂相少,形態不佳,達不到分析要求,無法進行進一步研究如fish等,使羊水產前診斷的應用受到限制。許爭峰等13
對傳統的羊水培養方法做了改良,取得了較滿意的效果。
1. 5　胚外體腔穿刺術
　是指於孕早期,在超聲引導下,用穿刺針刺入孕囊內的胚外體腔,抽吸液體用作產前診斷的一項新技術。由於此項技術最早可在孕6周進行,是目前可以開展的較早的產前診斷取材技術。自 1993 年 ,jurkovic首次嘗試用於產前診斷以來,此項技術引起了國內外眾多研究者的關注。對於有家族史的孕婦應儘早進行基因診斷 ,胚外體腔穿刺應是採集胎兒dna最好的方式。孫路明等對這項技術進行研究後認為,胚外體腔穿刺術是安全的,但若要正式用於臨床,其遠期安全性尚需進一步探討。

2　基因診斷
2. 1　pcr2sscp
　結合限制性內切酶分析fgfr3 跨膜區基因第1138位核苷酸發生g2a鹼基轉換後將產生sfe∧誶忻肝壞 ,抽提軟骨發育不全患者的dna, pcr 擴增含有fgfr3基因高發突變位點 g380r區域 ,將 pcr 產物直接用限制性內切酶sfe消化,15 %page凝膠電泳。電泳檢測結果是軟骨發育不全患者將出現正常 pcr產物條帶及其被內切酶消化後的2條帶,而患者父母及正常人僅出現pcr產物相同大小的單條帶。pcr2限制性酶切法已經成為國內外實驗室常用的對軟骨發育不全患者 fgfr3 基因常見突變進行檢測的方法15。
2. 2　基因測序
　 dna測序表明,軟骨發育不全患者95%以上的突變是fgfr3跨膜區基因第1138位核苷酸g 2a鹼基轉換 ,其餘則為 g 2c突變 ,這兩種突變都導致了fgfr3 跨膜區第380位密碼子的錯義突變(甘氨酸gly替換為精氨酸arg)。對於有條件的實驗室,可以直接透過對 pcr產物的基因測序來檢測 fgfr3 跨膜區基因的突變 ,將測序結果和正常基因序列對照 ,若能發現第1138位核苷酸發生g2a或g 2c的鹼基轉換則可確診為軟骨發育不全,若與正常序列相同則可完全排除。由於基因測序尚不能保證 100 %的準確性,故應取不同pcr產物從兩端分別進行測序才能確診。
2. 3　基因晶片技術
　基因晶片技術具有大規模、高通量、速度快、準確度高等優點,故診斷一些基因突變引起的遺傳病具有很高的價值。pinar等研製出診斷軟骨發育不全的電化學晶片,併成功地用於軟骨發育不全的基因診斷,基因晶片診斷不但可以明確有無突變,而且能明確突變型別,高密度晶片診斷能達到與基因測序一樣的準確性,並且能夠明確患者是雜合子還是純合子,產業化的晶片相對基因測序也更易於普及。基因晶片診斷技術將是未來軟骨發育不全基因診斷的發展方向。

3　胚胎植入前診斷
　胚胎植入前診斷(preimplantation ge2netic diagonosis ,pgd) 通常指從獲得的卵母細胞取極體或從體外受精的胚胎的部分細胞進行檢測,將確診無遺傳病的胚胎移植入子宮,從而防止遺傳病代代相傳。首次pgd在1989年由 handyside 所在的生殖中心報道,並於次年妊娠獲得成功。至今已有分佈於17個國家的 100 多個生殖中心建立了pgd技術,大約已經進行了5000 個 pgd 的臨床治療週期,接近1000例妊娠。rechitsky等已經成功地開展了軟骨發育不全的 pgd。但是,因為軟骨發育不全80 %以上無家族史,僅對患者進行 pgd是不安全的,確保無任何遺傳病變嬰兒的出生,是產前診斷的最終目標。對每例移植胚胎均在植入前進
行軟骨發育不全的突變篩選才是最安全的。