結核分枝桿菌的微生物學檢查法

　　結核病的症狀和體徵往往不典型，雖可藉助x線攝片診斷，但確診仍有賴於細菌學檢查。

　　標本　標本的選擇根據感染部位。可取痰、支氣管灌洗液、尿、糞、腦脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相應部位分泌液或組織細胞。

直接塗片鏡檢　標本直接塗片或集菌後塗片，用抗酸染色。若找到抗酸陽性菌即可初步診斷。抗酸染色一般用ziehl-neelsen法。為加強染色，可用ik(intensified kinyoun)法染色。將石炭酸復紅染色過夜，用0.5% 鹽酸乙醇脫色30s，則包括大多結核分枝桿菌l型也可著色。為提高鏡檢敏感性，也可用金胺染色，在熒光顯微鏡下結核分枝桿菌呈顯金黃色熒光。

　　濃縮集菌　先集菌後檢查，可提高檢出率。培養與動物試驗也必須經集菌過程以除去雜菌。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉澱集菌。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等汙染標本需經4% naoh（痰和鹼的比例為1:4,尿、支氣管灌洗液和鹼的比例為1:1）處理15min，時間過長易使結核分枝桿菌l型與非結核分枝桿菌死亡。尿標本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml於錐形量筒內靜置，取沉澱物處理。處理後的材料再離心沉澱。取沉澱物作塗片染色鏡檢。若需進一步作培養或動物接種，應先用酸中和後再離心沉澱。

　分離培養　將經中和集菌材料接種於固體培養基，器皿口加橡皮塞於37℃培養，每週觀察1次。結核分枝桿菌生長緩慢，一般需2～4周長成肉眼可見的落菌。液體培養可將集菌材料滴加於含血清的培養液，則可於1～2周在管底見有顆粒生長。取沉澱物作塗片，能快速獲得結果，並可進一步作生化、藥敏等測定和區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌。國內學者已證明結核分枝桿菌l型可存在於血細胞內或粘附於細胞表面。這種患者往往血沉加快，用低滲鹽水溶血後立即接種高滲結核分枝桿菌l型培養基能提高培養陽性率。

動物試驗　將集菌後的材料注射於豚鼠腹股溝皮下，3～4周後若區域性淋巴結腫大，結核菌素試驗陽轉，即可進行解剖。觀察肺、肝、淋巴結等器官有無結核病變，並作形態、培養等檢查。若6～8周仍不見發病，也應進行解剖檢查。

快速診斷　一般塗片檢查菌數需5x103～4/ml,培養需1x102/ml,標本中菌數少於此數時不易獲得陽性結果，且培養需時較長。目前已將多聚酶鏈反應（pcr）擴增技術應用於結核分枝桿菌dna鑑定，每ml中只需含幾個細菌即可獲得陽性，且1?2d得出結果。操作中需注意實驗器材的汙染問題，以免出現假陽性。又細菌l型由於缺壁並有代償性細胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使細胞膜破裂釋出dna，以致造成pcr假陰性。用組織磨碎器充分研磨使細胞破裂後，則可出現陽性。目前有條件的單位使用bactec法，以含14c棕櫚酸作碳源底物的7h22培養基，測量在細菌代謝過程中所產生的14c量推算出標本中是否有抗酸桿菌，5～7d就可出報告。

　　近年來國內外研究證明臨床各種型別的肺結核患者中40% 左右分離出l型。經治療的結核病人細菌型消失，l型常持續存在。有空洞患者痰中已不排細菌型者，8% 左右仍可檢出l型。故有學者建議將多次檢出l型亦作為結核病活動判斷標準之一，細菌型與l型 均轉陰才能作為痰陰性。